原理:
在不加條件下直接凍存細(xì)胞時,細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶,能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等,能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑,可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下,能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快,使之迅速通過細(xì)胞易受損的-5~0℃,細(xì)胞仍能生長,活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對細(xì)胞無毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細(xì)胞。
操作步驟
一、凍存
1、消化細(xì)胞,將細(xì)胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng),計數(shù),調(diào)整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中,每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口,封口要嚴(yán),否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。
6、貼上標(biāo)簽,寫明細(xì)胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。
7、按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。
注意:操作時應(yīng)小心,以免液氮**。液氮定期檢查,隨時補充,不能揮發(fā)干凈,一般30立升的液氮能用1~1.5月。
二、復(fù)蘇
1、準(zhǔn)備一個茶缸或1000ml的燒壞,內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。
3、打開凍存管,將細(xì)胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘,棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養(yǎng)液,吹打均勻,再離心10分鐘,棄上清液。
6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng),**天觀察生長情況。
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